收藏：0- 资源标识：CSTR:13153.11.20140601.AMD.PDPINK1DJ-1.01.KIZ
- 数据时间：2014年6月1日-2021年6月24日
- 动物品种：猕猴
- 关键词：帕金森病，基因编辑，猕猴模型，运动症状， PINK1，DJ-1
- 学科分类：神经生物学
- 数据分类：动物模型数据，组织学数据，行为学数据
- 共享方式：协议共享
- 所有者：胡新天课题组
- 单位：中国科学院昆明动物研究所
- 地址：云南省昆明市盘龙区茨坝街道龙欣路17号
- 邮编：650201
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- 服务邮箱：nhp@mail.kiz.ac.cn
- 服务单位：国家非人灵长类实验动物资源库
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预定
我们利用腺相关病毒血清型9（adeno-associated virus 9, AAV9）介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统，直接在两组猕猴（老年猕猴组和中年猕猴组）的偏侧黑质进行PINK1和DJ-1基因共同编辑，首次建成了具备PD核心表型的猕猴模型，也证明了基因和年龄同样在猕猴PD发展中起重要作用。该建模策略可在短时间内（6-10个月）构建大量基因编辑的PD猴，为PD病因与诊治研究提供可靠的猕猴模型。
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- 数据详细描述
- 数据文件列表
- 文献引用方式
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⑴行为学数据
为了评估猕猴PD症状，我们从三方面收集行为数据：1）记录猕猴的日常行为量化PD症状，使用改进版Kurlan量表（旧大路猴帕金森病经典评定量表）进行评分；2）通过阿扑吗啡（Apo）诱导的旋转反映黑质-纹状体多巴胺功能缺陷；3）通过食物抓取任务测量精细运动。
我们利用数码相机（Sony HDR-XR260，日本）收集每只猕猴的录像。实验期间，共收集日常行为数据七次，在第0周（基线），术后第6、10、12、14、16和18周的每周三上午进行。
为了检测基因编辑对黑质-纹状体多巴胺功能的影响，我们采用经典的药理学试验，即Apo诱导的旋转进行评估。首先，在1小时的视频中，从第15分钟到第45分钟的30分钟内，对每只猕猴自发旋转进行计数。其次，猕猴肌注Apo 10分钟后，再次拍摄1小时的视频。同样从第15分钟到第45分钟的30分钟内进行旋转计数。注射前5分钟，将2 mg的Apo溶解于2 mL（1 mg/mL）的维生素C溶液（0.5 mg/2 mL）。在第0周（基线）、术后第6周、第10周、第12周、第14周的每周三，行为录像后进行药理学测试。
为了评价猕猴PD发展过程中精细运动障碍，我们进行简易的食物抓取测试。猕猴从笼子前的食物盒内拿一块食物作为奖励。抓取行为稳定后，收集基线数据。记录每只猕猴抓取食物的潜伏期、正确率和利手偏好。每只猕猴须在每个测试周的三天内完成180次测试（每天60次）。猕猴在第0周（基线）、术后第6周、第10周、第12周、第14周进行测试。
⑵PD病理染色
TH染色：猕猴双侧黑质的冠状切片用3% H2O2（5 min）、3% triton X-100（4 min，中国北京索莱宝）和山羊血清（15 min，中国福州迈新）处理，然后兔抗TH抗体（1:1000，AB152，Millipore）4 °C过夜。次日，切片与二抗（PV-9000，30 min，中国北京中杉金桥）37 °C孵育。之后DAB显色2 min（DAB-1031 Kit，20×，中国福州迈新），苏木精复染细胞核。
PSer129αS染色：切片用10 μM/ mL蛋白酶K（中国上海阿拉丁）在10 mM Tris-HCl，pH=7.8、100 mM NaCl，0.1％ Tween-20（Bio-Rad，美国）中37°C处理30 min。之后用3％ H2O2（5 min，中国福州迈新）、3％ Triton X-100（4 min，中国北京索莱宝），10％山羊血清处理（15 min，中国福州迈新），经典的兔抗PSer129αS多克隆抗体（1：100，ab59264，Abcam，美国）4°C过夜。次日，切片与抗兔/小鼠二抗试剂盒（PV 9000，中国北京中杉金桥）37°C孵育30 min。之后DAB显色2 min（DAB-1031Kit，20×，中国福州迈新），苏木精复染细胞核。
染色后，所有切片乙醇梯度脱水并用二甲苯透明，中性树脂封片，光学显微镜（奥林匹斯，CX41；照相机：奥林匹斯DP25；软件：cellSens Entry 1.4.1；日本）采集照片。每只猕猴选取10张黑质冠状切片的左右区域，对TH阳性细胞和PSer129αS聚集进行计数。
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⑴行为学数据
两名有经验的视频分析员参与录像分析。评分者不知每只猕猴的实验操作，他们使用改进版Kurlan量表（Smith RD, Zhang Z, Kurlan R, McDermott M, Gash DM. Developing a stable bilateral model of parkinsonism in rhesus monkeys. Neuroscience 1993, 52: 7-16）对视频片段打分。该量表包括4个部分：A部分：帕金森病特征；B部分：药物副作用；C部分：总体活动水平；D部分：临床分期。PD评分依据A部分得出，总分为20，包括震颤：0-3；姿势：0-2；步态：0-4；运动迟缓：0-4；平衡：0-2；总体运动技能：0-3；防御反应：0-2。两位评分者的得分如果没有明显差异（少于两分），将数据汇总；若评分出现较大差异，则由实验者检查，最终评分将通过一起观看视频确定。在旋转计数中，两名视频分析员同样不知猕猴的实验操作，统计视频中猕猴的旋转次数。
⑵PD病理特征染色数据
通过ImageJ软件（National Institutes of Health，Bethesda，Maryland，USA）在40×物镜下对选定区域的黑质多巴胺能神经元（TH阳性染色细胞）计数。分别算出猕猴对照侧和基因编辑侧的平均细胞密度（个数/mm2）。为了验证计数方法的可靠性，黑质多巴胺能神经元的总数通过与Garcia等（Garcia-Dominguez I, Vesela K, Garcia-Revilla J, Carrillo-Jimenez A, Roca-Ceballos MA, Santiago M, et al. Peripheral Inflammation Enhances Microglia Response and Nigral Dopaminergic Cell Death in an in vivo MPTP Model of Parkinson's Disease. Front Cell Neurosci 2018, 12: 398）和Gundersen等（Gundersen HJ, Bagger P, Bendtsen TF, Evans SM, Korbo L, Marcussen N, et al. The new stereological tools: disector, fractionator, nucleator and point sampled intercepts and their use in pathological research and diagnosis. APMIS 1988, 96: 857-881）使用的方法估算，得出猕猴对照侧黑质多巴胺能神经元的平均总数约14800，与报道的结果一致（约14500）。黑质PSer129αS聚集计数时，发现阳性染色信号则进行统计。
为了验证基因编辑效果，通过Nikon A1共聚焦显微镜获取z-stack图像。分析EGFP+NeuN+和EGFP-NeuN+黑质细胞的Paris免疫染色的荧光强度用于定量PINK1的表达水平；分析EGFP+NeuN+和EGFP-NeuN+黑质细胞的DJ-1免疫染色的荧光强度，量化DJ-1的表达水平。
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a.实验动物和福利伦理
实验方案和动物福利均获得中国科学院昆明动物研究所伦理委员会的批准（IACUC No.15001）。猕猴单笼饲养，标准的明/暗周期，自由取食饮水，由兽医照看。共10只雄性成年猕猴参与PD建模。其中，4只用于初步研究，即尝试单独编辑PINK1（n=2，90067，95301）或DJ-1基因（n=2，95075，97081）；另4只进行PINK1与DJ-1基因共同编辑（n=4，070229，070209，94089，97093）；其余2只猕猴作为年龄匹配的正常对照（n=2，99357，91097），用于比较TH免疫组化染色结果。
b.行为数据采集要求：固定时间采样（每个实验周的周三上午10：00），固定时长（猕猴单笼自由活动1小时），固定距离（录像机位于笼子前方1米处），在没有外部干扰的情况下记录。
c.病理数据采集要求：黑质多巴胺能神经元主要位于黑质致密部，我们在4×物镜（3.5 mm × 2.6 mm）、20×物镜（690.8 μm × 518.1 μm）和40×物镜（345.4 μm × 259 μm）下鉴定具备典型多巴胺能神经元形态且呈现TH免疫组化阳性染色的细胞，以第三对脑神经3n为参考，选定黑质长轴近中心区域40×物镜拍照用于细胞计数。
d.以科学规范为原则，每条数据的采集、描述与数字化表达的每个环节均由专业人员操作，保证信息准确信及科学性。实验数据源于仪器测量，逐一录入。
